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从PCR实验室设计,看如何避免气溶胶污染

浏览:269 发表时间:2020-02-20 13:38:09


针对目前的新型冠状病毒检测,国家食品药品监督管理总局应急审批了好几款新型冠状病毒核酸检测试剂盒,作为新型冠状病毒诊断的有效方式之一。那么,从临床样本取样之后,到诊断分析完成,需要什么样的过程和环境要求去完成一次有效的核酸检测呢?


核酸检测常规流程为:样本取样、样本保存和处理、核酸提取、试剂配置、核酸扩增、扩增产物分析、扩增产物处理等阶段。其中样本保存和处理、核酸提取、核酸试剂配置、核酸扩增、扩增产物分析等阶段都需要PCR实验室中完成。


影响PCR实验结果的因素非常多,其中非常重要的一个因素就是PCR实验过程中的核酸气溶胶污染。极微量的核酸气溶胶污染,都有可能导致检测结果的假阳性,甚至导致检测实验的失败,因此消除PCR实验室气溶胶污染是保证PCR实验有效进行的重要方式。
PCR实验室中有哪些因素会造成气溶胶的污染?实验过程中又该如何消除和减小气溶胶的污染呢?一个合格的PCR实验室又需要有什么样的平面布局、基础设置、管理控制去保证一次有效的PCR实验过程呢?
那么,我们分别从PCR实验室预期用途、气溶胶产生、气溶胶危害、气溶胶污染的措施和建议等不同的方面进行阐述,增加读者对PCR实验室和实验过程控制措施的理解。


PCR实验室预期用途



根据预期用途,可作为生产企业产品质检使用、研发使用,医疗机构检测样本使用等。其中生产质检使用为决定成品的质量是否符合产品技术要求的指标,是否能够生产放行,上市销售。



PCR实验室气溶胶污染的产生


临床样本核酸提取过程、离心过程、剧烈地摇动反应管、PCR开盖、吸样时及移液器的反复吸样等等,都会产生核酸气溶胶。气溶胶随着人员的移动、气流的流动,物品的使用等不同的方式,逐渐扩散到整个PCR实验室



PCR实验室气溶胶的危害


实验室气溶胶污染看不见,摸不着,但是直接影响实验结果的正确性,影响诊断结果的判断,导致假阳性等。核酸污染后不能得到及时的消除,可能会扩散到整个PCR实验室,导致PCR实验室的功能失效,在污染消除前都不能进行PCR试验。



PCR实验室预防气溶胶污染的措施和建议


1、 实验室结构布局
a)      PCR实验室选址需要和核酸生产区在不同的建筑物内;若在同一建筑物内,需要在不同的独立空间内,保证气流不会直接连通,同时注意生产区和实验区新风取风口和排风口的位置,避免取排风之间的交叉影响和干扰;
b)     按照PCR试验的步骤:试剂储存和准备区、样本制备区、扩增区、扩增产物分析区,合理划分实验室区域;
c)      实验室各个区域有有效的物理隔离措施,保证气流不直接连通;
d)     采取有效的隔离措施,避免空调机组停机后,空气回流造成对各个房间气流的影响;
e)     按照试验的需求以及试验设备的功能,合理对区域进行合并;
f)      有效控制压差梯度,每个房间之间以传递窗进行连接,保证下一个工序房间的气流不会扩散到上游的房间;
g)     每个功能间前设置缓冲间,保证各个功能间之间气流的有效隔离,缓冲间设置联动装置,保证两个门不会被同时打开;


图A  缓冲间为负压的理想PCR检验实验室设置模式


图B  缓冲间为正压的理想PCR检验实验室设置模式


2、 实验室压差控制
a)      使用独立的空调机组(不能与其他区域空调机组共用,可以不为洁净区),按照理想正压(常用模式)或理想负压的模式控制房间的压差;
b)     每个房间有专用的出风口和排风口,排风方式为直排;
c)      试剂储存和准备区→标本制备区→扩增区→扩增产物分析区方向空气压力应当以递减的方式进行;
d)     合理设置压差表,监视所控制的压差,有效证明空气流向,压差梯度不宜低于5帕;
e)     需要注意,摆放生物安全柜的房间压差联动调节,确保生物安全柜启动,破坏虽有房间的静态压差平衡。


3、 试验环境控制
a)      进入到各个功能间的实验室人员,不能穿戴同一套工作服进入到其他的功能间;
b)     实验人员按照试验流程的顺序有序退出,不能返回移动;试验完成之后,从走廊尾端的门出PCR实验室;
c)      各个房间的清洁设施设备,不能共用,使用不同的颜色或者标识进行有效的区分;
d)     实验室用的废弃物,必须要密封完成之后,才能拿出实验室后进行处理;
e)     物品传递通过每个房间的传递窗进行传递,传递窗有互锁装置,保证两个门不能同时打开。


4、 试验过程注意事项
a)      应当避免气溶胶所致的污染,尽量减少在扩增区内的走动,扩增反应管不得在扩增区打开,密封后移除实验室,灭菌处理;
b)     实验室人员必须穿戴专用的工作服、工作鞋、一次性手套、口罩;
c)      每个实验室配备适当的消毒设备,如紫外灯、75%乙醇等;
d)     样本制备区配备与处理样本生物安全等级相应的生物安全柜;
e)     每次试验操作完成之后,及时对操作区域进行清洁消毒处理;
f)      应当注意PCR反应液加样的顺序,应当为空白样品→阴性对照→样品→阳性对照;
g)     对具有潜在传染危险性的材料,应当在生物安全柜内开盖,并有明确的样本处理和灭活程序
h)     为避免样本间的交叉污染,加入待测核酸后,应当盖好含反应混合液的反应管

总结


PCR试验的全过程中有很多原因可能导致核酸气溶胶的污染,造成检测结果的失效甚至试验的失败。因此,PCR实验室所采取的的一切的选址、结构布局、基础设施、控制方式、管理制度等方式都是为了消除和减小气溶胶造成的污染,保证检测试验的有效进行。




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